Bài 2. Tách chiết DNA từ tế bào

CH tr 14 MĐ

Hầu hết các nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử như giải trình tự gene, nhân dòng gene, tạo thư viện DNA,… đều cần phải thu nhận được một lượng DNA đủ lớn, đủ sạch và ở trạng thái nguyên vẹn. Bằng phương pháp nào mà các nhà khoa học có thể thu nhận được từ các phân tử DNA như mong muốn?

Phương pháp giải:

Hầu hết các nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử như giải trình tự gene, nhân dòng gene, tạo thư viện DNA,… đều cần phải thu nhận được một lượng DNA đủ lớn, đủ sạch và ở trạng thái nguyên vẹn.

Lời giải chi tiết:

Để thu nhận được các phân tử DNA như mong muốn, các nhà khoa học đã tiến hành tách chiết DNA từ tế bào.

CH tr 14 CH 1

Quan sát hình 2.1, hãy mô tả quy trình cơ bản tách chiết DNA từ tế nào.

Phương pháp giải:

Quan sát hình 2.1

Lời giải chi tiết:

Có 4 bước để tách chiết DNA từ tế bào:

- Bước 1: Chuẩn bị mẫu sinh phẩm

- Bước 2: Ly giải tế bào

- Bước 3: Loại bỏ các thành phần không mong muốn

- Bước 4: Thu nhận DNA

CH tr 14 CH 2

Hãy cho biết nguyên lí của phương pháp tách chiết DNA.

Phương pháp giải:

Dựa vào hình 2.1

Lời giải chi tiết:

Nguyên lí của phương pháp tách chiết DNA: giải phóng DNA còn nguyên vẹn vào dung dịch tách chiết, loại bỏ các tạp chất để thu nhận DNA tinh sạch.

CH tr 15 CH 1

Quan sát hình 2.2, cho biết mục đích và cơ chế của quá trình li giải tế bào.

Phương pháp giải:

Quan sát hình 2.2

Lời giải chi tiết:

Mục đích:

- Thu thập nội dung tế bào: Để nghiên cứu, phân tích hoặc sử dụng các thành phần bên trong tế bào như DNA, RNA, protein.

- Chuẩn bị mẫu cho các kỹ thuật phân tích

Cơ chế:

- Sử dụng enzym phân giải (lytic enzymes): Enzym phân giải như lysozyme, proteinase K, hoặc SDS (sodium dodecyl sulfate) được sử dụng để phá vỡ thành phần cấu trúc của tế bào.

- Phá vỡ màng tế bào: Enzyme phân giải tác động lên thành màng tế bào, phá vỡ màng và tường tế bào, giải phóng nội dung tế bào ra môi trường ngoài.

- Tạo điều kiện lý tưởng: Sử dụng các dung môi, nhiệt độ, pH, và áp suất thích hợp để tối ưu hóa quá trình ly giải.

CH tr 15 CH 2

Quá trình ly giải các loại tế bào có đặc điểm gì khác nhau?

Phương pháp giải:

Dựa vào đặc điểm từng loại tế bào

Lời giải chi tiết:

- Đối với tế bào vi khuẩn, chúng thường tồn tại ở dạng các tế bào đơn lẻ, không có cấu trúc khung xương, không tích lũy lipid cũng như các hợp chất sinh học thứ cấp nên quá trình tách chiết thường đơn giản.

- Đối với tế bào mô thực vật và động vật có kích thước lớn nên thường phải nghiền nhỏ trong môi trường chứa nitrogen lỏng thành các hạt mịn để dễ dàng tách chiết DNA. Bên cạnh đó, tế bào thực vật có thành tế bào vững chắc nên cần sử dụng thêm các biện pháp cơ học (nghiền bằng cối, dùng máy xay) hoặc enzyme để phá vỡ thành tế bào. Mô động vật cần xử lý bằng enzyme để pha.

CH tr 16 CH 1

Quan sát hình 2.3, hãy mô tả các bước loại bỏ protein

Phương pháp giải:

Quan sát hình 2.3

Lời giải chi tiết:

- DNA/RNA và protein trong pha nước được bổ sung vào dung dịch chiết hỗn hợp dung môi hữu cơ phenol : chloroform (tỉ lệ 1:1) để gây biến tính và kết tủa protein.

- Tiến hành ly tâm để tách protein và lipid ra khỏi hỗn hợp DNA và RNA.

- Sau khi ly tâm, thu được hỗn hợp gồm 2 pha: pha nước và pha dung môi hữu cơ. 

CH tr 16 CH 2

Tại sao việc tách DNA bằng dung môi hữu cơ thường được tiến hành cùng với li tâm?

Phương pháp giải:

Li tâm giúp tách lấy phân tử DNA từ mẫu sau khi đã phá vỡ tế bào và chiết lấy DNA.

Lời giải chi tiết:

- Tách chiết DNA: Quá trình tách chiết DNA là bước đầu tiên để thu được DNA tinh khiết từ một mẫu chứa nhiều loại tế bào hoặc các chất khác nhau. Li tâm giúp tách lấy phân tử DNA từ mẫu sau khi đã phá vỡ tế bào và chiết lấy DNA.

- Tinh sạch DNA: Sau khi tách chiết được DNA, quá trình tinh sạch loại bỏ các tạp chất và các phân tử khác trong mẫu để thu được DNA tinh khiết. Li tâm giúp tách lấy phần tinh khiết của DNA mà không bị nhiễm tạp.

- Hiệu quả và tiết kiệm thời gian: Li tâm là phương pháp nhanh chóng và hiệu quả để tách lấy DNA từ dung dịch. Nó giúp tập trung DNA vào một vị trí cụ thể trong ống nghiệm, dễ dàng thu lấy phần tinh khiết.

- Phòng ngừa nhiễm tạp: Li tâm giúp ngăn chặn việc nhiễm tạp từ các tế bào khác hoặc các chất khác trong mẫu, đảm bảo DNA thu được là tinh khiết.

CH tr 16 LT

Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa có những ưu điểm và hạn chế gì?

Phương pháp giải:

Lý thuyết phương pháp tủa DNA

Lời giải chi tiết:

Ưu điểm:

- Thời gian thực hiện nhanh: So với một số phương pháp khác, tách chiết bằng phương pháp tủa thường nhanh chóng (khoảng 35 phút cho 10 mẫu).

- Chi phí thấp: Phương pháp này không đòi hỏi nhiều hóa chất và thiết bị phức tạp, giúp giảm chi phí so với một số phương pháp khác.

Nhược điểm

- Độ tinh sạch thấp: So với một số phương pháp khác như tách chiết bằng cột silica, phương pháp tủa có độ tinh sạch thấp hơn.

- Thời gian tách chiết khá lâu: Mặc dù nhanh hơn so với một số phương pháp khác, nhưng vẫn cần thời gian tương đối để hoàn thành quy trình.

- DNA/RNA thu nhận không lưu được lâu: DNA/RNA thu được bằng phương pháp tủa không thể bảo quản lâu hơn một thời gian ngắn.

CH tr 17 CH 1

Quan sát hình 2.4, hãy mô tả quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp cột silica. 

Phương pháp giải:

Quan sát hình 2.4

Lời giải chi tiết:

Quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp cột silica gồm 4 bước:

- Bước 1: Ly giải tế bào

- Bước 2: Gắn cột

- Bước 3: Rửa

- Bước 4: Thu nhận DNA

CH tr 17 CH 2

Hãy cho biết nguyên lí của phương pháp cột silica là gì?

Phương pháp giải:

Quan sát hình 2.4

Lời giải chi tiết:

Nguyên lí: Hoạt động của muối chaotropic làm phá vỡ mạng lưới các liên kết hydrogen, tương tác Van Der Waals và tương tác kỵ nước nhằm tạo điều kiện cho DNA liên kết với màng silica.

CH tr 18 LT

Nếu bỏ qua bước làm khô cột silica thì sẽ gây khó khăn gì cho quá trình thu nhận DNA?

Phương pháp giải:

Dựa vào nguyên lí phương pháp cột silica.

Lời giải chi tiết:

- Độ tinh sạch thấp: Bước làm khô cột silica giúp loại bỏ tạp chất và các phân tử khác khỏi DNA. Nếu bỏ qua bước này, DNA thu được có thể chứa nhiều tạp chất, ảnh hưởng đến độ tinh khiết của mẫu.

- Khả năng lưu trữ: DNA thu nhận từ quá trình tách chiết bằng cột silica thường có thể lưu trữ lâu hơn so với DNA thu được từ phương pháp khác. Bỏ qua bước này có thể làm giảm khả năng lưu trữ của DNA.

- Hiệu suất PCR và phân tích gen: Độ tinh khiết của DNA ảnh hưởng đến hiệu suất của các phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) và phân tích gen. DNA không tinh khiết có thể làm giảm độ nhạy của các phản ứng này.

CH tr 12 VD

Để đảm bảo quá trình tách chiết DNA thành công, các nhà khoa học cần quan tâm đến yếu tố:

Quá trình ly giải tế bào.

Nồng độ ethanol được sử dụng.

Quá trình gắn DNA lên màng silica (trong phương pháp cột silica).

Hãy cho biết yếu tố trên ảnh hưởng như thế nào đến quá trình tách chiết DNA.

Phương pháp giải:

Phương pháp tách chiết DNA

Lời giải chi tiết:

Quá trình ly giải tế bào

- Tách lấy DNA và protein: Khi quá trình ly giải tế bào xảy ra, hạt nhân và tế bào bị phân tách, giải phóng DNA và protein. Quá trình này sử dụng cơ chế cơ học, enzyme và chất tẩy như Proteinase K để tan chảy các protein tế bào và giải phóng DNA.

- Tách lấy DNA tinh khiết: Quá trình ly giải tế bào giúp tách lấy DNA tinh khiết từ các thành phần tế bào khác. Điều này đặc biệt quan trọng khi chúng ta muốn thu được DNA tinh khiết cho các mục đích như phân tích gen hoặc PCR (Polymerase Chain Reaction).

- Loại bỏ tạp chất: Quá trình ly giải tế bào giúp loại bỏ các tạp chất, như protein, lipid và các hợp chất khác, để thu lấy DNA tinh khiết hơn.

Nồng độ ethanol được sử dụng

- Tạo kết tủa DNA: Ethanol giúp tạo kết tủa DNA từ dung dịch. Khi thêm ethanol vào dung dịch chứa DNA, DNA sẽ kết tụ lại thành hạt, rơi xuống đáy ống nghiệm. Điều này giúp tách lấy DNA khỏi các tạp chất khác trong mẫu.

- Tăng nồng độ DNA: Ethanol làm cho DNA ít tan hơn trong dung dịch. Molekul In ethanol tạo liên kết hidro với nước, giảm số lượng phân tử nước có sẵn để hydrat hóa DNA. Kết hợp với hiệu suất kém của ethanol trong việc giữ các ion dương và DNA cách xa nhau, DNA kết tụ lại và tạo thành kết tủa.

Loại bỏ tạp chất: Ethanol cũng giúp loại bỏ các tạp chất như muối và chất tẩy. Quá trình rửa bằng ethanol loại bỏ các tạp chất nhẹ như muối và detergent.

- Lựa chọn nồng độ: Nồng độ ethanol thường được điều chỉnh để đạt được hiệu suất tốt nhất. Thông thường, dung dịch ethanol 70% được sử dụng trong các bước rửa DNA.

Quá trình gắn DNA lên màng silica (trong phương pháp cột silica)

- Tách lấy DNA và protein: Màng silica được gắn vào hỗ trợ rắn, giúp tách lấy phần lớn acid nucleic (DNA/RNA) ra khỏi các tạp chất trong mẫu. Điều này đặc biệt quan trọng khi chúng ta muốn thu được DNA tinh khiết cho các mục đích như phân tích gen hoặc PCR (Polymerase Chain Reaction).

- Giảm nguy cơ nhiễm tạp: Sử dụng màng silica giúp giảm nguy cơ nhiễm tạp từ các hạt thủy tinh (glass beads) trong quá trình tách chiết. Đồng thời, nó cũng giảm nguy cơ cắt gãy các đoạn DNA lớn hơn 3 đến 10 kb.

- Tạo kết tủa DNA: Màng silica giúp tạo kết tủa DNA từ dung dịch. Khi thêm dung dịch chứa DNA vào cột silica, DNA sẽ kết tụ lại thành hạt, rơi xuống đáy cột. Điều này giúp tách lấy DNA khỏi các tạp chất khác trong mẫu.

- Loại bỏ tạp chất: Màng silica loại bỏ tạp chất như muối và chất tẩy. Quá trình rửa bằng ethanol loại bỏ các tạp chất nhẹ như muối và detergent.